您好,今天飛哥來為大家解答以上的問題。熒光定量pcr引物設計條件，熒光定量pcr引物設計原則相信很多小伙伴還不知道,現在讓我們一起來看看吧！

1、參照以下real-time PCR引物設計原則：1.最好位于編碼區5’端的300-400bp區域內,可以用DNAman,Alignment 軟件看看結果.2.產物不能形成二級結構（自由能小于58.61KJ/mol）.3.引物長度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大.4.G+C含量在40%~60%之間,45-55％最佳.5.堿基要隨機分布,盡量均勻.6.引物自身不能有連續4個堿基的互補.7.引物之間不能有連續4個堿基的互補.8.引物5′端可以修飾.9.3’端不要以A結尾,3′端不可修飾,而且要避開AT,GC rich的區域,避開T/C,A/G連續結構（2-3個）.10.引物3′端要避開密碼子的第3位.11.引物整體設計自由能分布5‘端大于3’端,且3‘端自由能最好小于9KJ/mol.可用oligo 6 軟件進行比對看結果的情況.12.做熒光定量產物長度80-150bp最好,最長是300bp.13.引物設計避免DNA污染,最好跨外顯子接頭區.14.引物與非特異性擴增序列的同源性最好小于70％或者有8個互補堿基同源.15.查看有無假基因的存在.假基因就是無功能的DNA序列,與需要擴增的目的片段長度相似.16.TM值在55-63度之間.17..引物與非特異性擴增序列的同源性最好小于70％或者有8個互補堿基同源.。

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